Большой аномалией правления этого рационалиста было преследование ереси. Фридрих не допускал свободы мысли и слова даже для профессоров своего университета; это была привилегия, ограниченная им самим и его приближенными. Как и большинство правителей, он признавал необходимость религии для общественного порядка и не мог позволить, чтобы ее подрывали его ученые; кроме того, подавление ереси способствовало периодическому миру с римскими папами. В то время как некоторые другие монархи XIII века не решались сотрудничать с инквизицией, Фридрих оказал ей полную поддержку. Папы и их главный враг были согласны только в этом.
По мере того как Фридрих правил в Фоггии, его далеко идущие цели становились все более ясными: установить свою власть на всей территории Италии, объединить Италию и Германию в восстановленную Римскую империю и, возможно, вновь сделать Рим не только политической, но и религиозной столицей западного мира. Когда в 1226 году он пригласил дворян и города Италии на диету в Кремону, он показал свою руку, включив в приглашение герцогство Сполето, которое в то время было папским государством, и проведя свои войска через земли пап. Папа запретил дворянам Сполето присутствовать на празднике. Ломбардские города, подозревая, что Фридрих планирует добиться от них реального, а не номинального подчинения империи, отказались прислать делегатов; вместо этого они образовали вторую Ломбардскую лигу, в которой Милан, Турин, Бергамо, Брешия, Мантуя, Болонья, Виченца, Верона, Падуя и Тревизо обязались заключить оборонительный и наступательный союз на двадцать пять лет. Диета так и не состоялась.
В 1234 году его сын Генрих восстал против отца и заключил союз с Ломбардской лигой. Фредерик прибыл из южной Италии в Вормс без армии, но с большим количеством денег; восстание рухнуло при известии о его приезде или прикосновении к его золоту; Генрих был посажен в тюрьму, томился там семь лет, а затем, когда его переводили в другое место заключения, насмерть свалился на лошади со скалы. Фридрих отправился в Майнц, возглавил там диету и уговорил многих собравшихся дворян присоединиться к нему в кампании по восстановлению императорской власти в Ломбардии. Получив такую помощь, он разбил армию Лиги при Кортенуове (1237); сдались все города, кроме Милана и Брешии; Григорий IX предложил посредничество, но мечта Фридриха о единстве не могла примириться с любовью итальянцев к свободе.
В этот момент Григорий, хотя ему было девяносто лет и он был болен, решил бросить свой жребий вместе с Лигой и рискнуть всей временной властью пап в вопросе войны. Он не питал любви к лангобардским городам; он, как и Фридрих, считал их свободу разрешением на беспорядочные распри; он знал, что они укрывают еретиков, открыто враждебных богатству и временной власти Церкви; в это самое время еретики осажденного Милана оскверняли алтари и переворачивали распятия вверх ногами.45 Но если бы Фридрих одолел эти города, папские государства были бы поглощены единой Италией и единой империей, в которой доминировал бы враг христианства и Церкви. В 1238 году Григорий убедил Венецию и Геную присоединиться к нему и Лиге в войне против Фридриха; в мощной энциклике он обвинил императора в атеизме, богохульстве, деспотизме и желании уничтожить авторитет Церкви; в 1239 году он отлучил его от церкви, приказал всем римско-католическим прелатам объявить его вне закона и освободил его подданных от клятвы верности. Фридрих ответил циркулярным письмом королям Европы, отвергая обвинения в ереси и обвиняя папу в желании разрушить империю и привести всех королей к подчинению папству. Началась последняя борьба между империей и папством.
Короли Европы сочувствовали Фридриху, но не обратили внимания на его призыв о помощи. Дворянство в Германии и Италии встало на его сторону, надеясь вернуть города к феодальному повиновению. В самих городах средние и низшие классы были в целом за папу; и старые немецкие термины Waibling и Welf, в форме Ghibelline и Guelf, были возрождены, чтобы обозначать соответственно приверженцев империи и защитников папства. Даже в Риме это разделение сохранялось, и у Фридриха было много сторонников. Когда он с небольшой армией подходил к Риму, один город за другим открывал перед ним свои ворота, как перед вторым цезарем. Григорий ожидал пленения и возглавил траурную процессию священников через столицу. Мужество и хрупкость старого Папы тронули сердца римлян, и многие взялись за оружие, чтобы защитить его. Не желая форсировать события, Фридрих обошел Рим и зазимовал в Фоджии.